《健康中国行动（2019—2030年）》提出，到2030年，成人每日平均睡眠时间要达到7-8小时。然而，现代社会生活节奏快，生活、工作压力不断加大，睡不着、睡不好、睡不够……成为困扰人们身心健康的大问题。“睡眠”话题在社交软件中出现得越来越频繁，睡眠不足和睡眠问题带来的健康影响愈发引起人们重视。

与此同时，人们也在不断地尝试各种方法改善睡眠状况。从各类药物助眠到线上助眠，选择繁多。然而，在这个对睡眠健康提出更高要求的时代，寻找一种天然、健康、安全的助眠方式成为了现代人的追求。

本期关键词：迷迭香纯露；失眠症；RNA-Seq；5-羟色胺能突触加权系数

前言

迷迭香是一种原产于地中海盆地的草本植物，属于唇形科。由于其能够承受干燥、温暖的环境条件并能在多种土壤地质条件下生长，因此它的适应性很强，可以在世界范围内种植。迷迭香的主要化学成分是α-蒎烯、桉树脑、迷迭香酸和樟脑。迷迭香精油已被证明可以改善焦虑、抑郁和睡眠障碍。迷迭香可用于治疗失眠引起的情绪障碍和抑郁症，并且常被制成茶来发挥其治疗失眠的作用。但其作用机制以及在治疗失眠方面发挥作用的成分尚需进一步研究。

在本研究中，我们通过RNA‑seq、网络药理学和药效实验研究了口服迷迭香纯露对PCPA诱导的失眠大鼠的治疗作用。对迷迭香纯露进行气相色谱‑质谱（GC‑MS）分析，并利用其成分含量与OB值的乘积计算“量效”权重系数，对GO和KEGG通路的结果进行排序。迷迭香纯露通过血清素能突触显示出对失眠的治疗作用。该研究采用酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法、Rt‑PCR、免疫组化药理学实验和动物行为观察来验证治疗机制，旨在为开发迷迭香纯露作为具有广泛应用前景的具有治疗失眠功效的饮料提供实用依据。

过程及结果

•.迷迭香纯露的GC‑MS分析

通过GCMS分析迷迭香纯露的活性成分，并获得纯露的离子质谱图（图1A）。结合NIST数据库和保留指数筛选共得到23种活性成分，鉴定出19种迷迭香纯露合格成分，如表2所示。

•RNA‑seq分析结果

从Omicsmart在线分析平台共获得1579个差异基因靶点，FDR≤0.05，差异数为1，PCA如图2A所示。其中，空白中与模型相比，有945个上调基因，613个下调基因。差异基因火山图如图2B所示，差异基因热图如图2C所示。对空白和模型中两组差异基因进行KEGG和GO富集分析。

在分析了与神经系统疾病相关的通路后，KEGG富集的通路有GABA能突触、尼古丁成瘾、cAMP信号通路、5‑羟色胺能突触等通路（图2D）。GO富集分析包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF），这些途径包括细胞过程、生物调节、结合和细胞部分途径等（图2E）。对于测序结果，使用KEGG和GO数据库对单个对照组中的所有基因进行GSEA，以说明与神经系统相关的疾病的富集。对于空白组和模型组，GSEA‑KEGG结果表明富集途径为肌萎缩侧索硬化症、5‑羟色胺能突触、神经营养因子信号通路和其他通路（如图2F所示）。GSEA‑GO结果显示这些途径包括蛋白质激活级联、补体激活和其他途径（如图2G所示）。

·GO和KEGG富集分析

使用R软件对29个基因进行GO和KEGG富集分析，GO分析共包括87个生物过程、45种细胞成分和61个分子功能途径。KEGG富集了18条通路，包括与神经活性配体受体相互作用、血清素能突触、GABA能突触和cAMP信号通路相关的通路。计算加权系数后，综合结果确定血清素突触途径是最重要的途径。结果如图4所示。5‑HTR1A、ADCY5、PKA和GABAA是涉及血清素突触通路的重要基因。

·迷迭香纯露对失眠大鼠的治疗作用

除空白组外，所有组经PCPA连续腹腔给药三天后，均出现昼夜节律丧失、攻击性增强、毛发蓬乱等现象，表明造模成功。经过六天地西泮和迷迭香纯露治疗后，各组的攻击性均有所降低，昼夜节律也出现明显变化，表明迷迭香纯露在改善失眠方面具有功效。

·旷场实验结果

对所有大鼠进行的旷场实验结果显示，与正常组（P<0.001）相比，模型组的站立能力、通过中心的次数和总活动度均显著减少。与模型组相比，地西泮组和迷水香组大鼠站立、中心和总活动量均升高(P<0.05、P<0.01；图6A、B、C）。（P<0.05和P<0.01；图6A、B和C）。

·血清5-HT、GABA、DA水平

结果显示血清中5HT和GABA减少，(P<0.05)，而失眠模型组与正常组相比DA显着降低(P<0.001；图6D、E、F)。与模型组比较，地西泮组和迷迭香纯露组血清5HT和GABA升高（P<0.05和P<0.01）。此外，与模型组比较，地西泮组和中、高剂量迷迭香纯露组血清DA升高（P<0.05和P<0.01），而低剂量迷迭香纯露组无显着升高（P>0.05）。

·免疫组化检测海马组织中5-HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA的表达

采用免疫组化法检测大鼠海马5HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA的表达水平。模型组5-HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA表达量较正常组显著降低（P<0.001）。与模型组相比，地西泮组和模型组的5HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA存在差异性升高。迷迭香纯露组（P<0.05和P<0.01）。结果表明，迷迭香纯露可诱导失眠大鼠海马组织中5HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA升高，如图7所示。

·蛋白质印迹分析

Western blot法检测大鼠海马5HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA蛋白的表达水平。模型组5-HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA表达量较正常组显著降低（P<0.001）。与模型组相比，地西泮组和所有三个剂量的迷迭香纯露组中5HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA均有差异升高。迷迭香中、高剂量组各蛋白表达量与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果如图8A-E所示。

·实时荧光定量聚合酶链反应（Rt-PCR）

采用Rt-PCR法检测大鼠海马5HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA mRNA的表达水平。结果显示，与正常组相比，模型组5HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA表达量显着降低（P<0.001），cAMP表达量降低（P<0.01）。与模型组比较，地西泮组和迷迭香纯露各组5HT1AR、cAMP、PKA表达均有差异性升高（P<0.05和P<0.01）。除迷迭香纯露外，所有组中ADCY5的表达均有差异性升高；除高剂量迷迭香纯露组外，所有组中GABAA的表达均显著增加（P<0.05）。

结论

上述结果表明，迷迭香纯露的有效成分为1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚烷-2-酮、3-甲基-4-异丙基苯酚、石竹烯、香茅醇，协同改善失眠症状。其中，石竹烯可通过调节5-HT1AR表达来治疗失眠，5-HT1AR表达增加5-HT含量并诱导参与血清素突触的ADCY5、cAMP、PKA和GABA上调。作用机制如图9所示。

通过上调5-羟色胺受体1A（5-HT1AR）作用于5-羟色胺受体1A（HTR1A）靶点，导致5-羟色胺5（ADCY5）、环腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）和γ-氨基丁酸A型（GABAA）释放增加；柠檬醇上调ADCY5和1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚烷-2-1和3-甲基-4-异丙基酚上调GABAA以改善失眠症状。

综上所述，我们引入了一种创新的“数量-效应”加权系数，结果表明迷迭香纯露可以通过多种成分作用于多个靶点，通过大鼠5-羟色胺能突触治疗大鼠失眠的功效。迷迭香纯露可以认为是一种治疗失眠的功能性饮料，可以缓解失眠症状，调节情绪，降低抑郁风险。

参考文献：

[1]Li T, Wang W, Guo Q, etal. Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) hydrosol based on serotonergic synapse for insomnia[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2023(318).